Ca2+ 染料
离子敏感染料是能够可逆结合特定离子的荧光分子。这些染料对离子浓度的变化非常敏感，且能实时通过荧光强度的增强或降低直接反映这些变化。离子与染料结合的亲和力的一个测量指标是解离常数 (Kd)。钙离子 (Ca2+) 的结合亲和力越低，Kd (Ca2+) 就越高。离子敏感染料主要分为两大类：1. 单波长染料，如 Fluo3 和 Calcium Green，适用于非比率测量。发射的荧光光强与游离离子浓度成正比增加。2. 双波长染料用于比率测量。这些指示剂也可以分为两组：双发射离子指示剂：这些染料在一个波长下被激发，并在结合特定离子时显示其发射光谱的变化。这个组别中一个著名且常用的指示剂是 Indo1。双激发离子指示剂：这些染料在两个不同的波长下被激发。发射的荧光光强度根据离子浓度的变化而变化。Fura2 是最常用的比率钙离子指示剂之一。
Fura2
Fura2 的未结合形式在 380 nm 处被激发，而结合形式在 340 nm 处被激发。发射的光在大约 510 nm 处被检测。随着钙离子浓度的增加，340 nm 处的荧光强度增加，而未结合形式在 387 nm 处的荧光强度则减少。有一些技术可以将荧光钙离子指示剂引入细胞，例如酯加载、微注射、化学加载技术或膜片钳玻璃管扩散。
有关不同钙离子指示剂、染料处理、细胞标记和细胞加载的更多信息，请参阅《分子探针手册》和 Takahashi 等人 (参见参考文献)。
图 1：不同钙浓度下 Fura2 的荧光激发光谱。参考文献：分子探针。
比例测量的好处通过比率方法可以避免由于染料分布不均、染料泄漏、光漂白和细胞厚度不均造成的误差。在典型的实验中，当你检测 Ca2+随时间的变化时，必须进行校准。校准可以在体外或体内进行。对于体内校准，测量最大和最小 Ca2+浓度的比率。这些值可以在同一实验中获得。为了获得最大量的结合 Ca2+指示剂，你可以添加离子载体如 Ionomycin 或 Bromo-A2318 来平衡 Ca2+浓度。要获得最小的 Ca2+浓度，你可以应用 EGTA 缓冲溶液来螯合所有的 Ca2+。
徕卡系统配置
系统必须配备外置滤光片转轮和 EL6000 光源。外置滤光片转轮包含用于 Fura2 在 340 nm 和 387 nm 的特殊激发滤光片。此外，您还需要相应的滤光块，包括一个分色镜和一个发射带通滤光片，确保510nm的发射波长可以被检测。
了解更多关于如何设置宽场钙成像实验的信息
详细信息：
成像实验条件的设置定义您的时间序列实验荧光强度比根据 Grynkiewicz 计算钙浓度你可以在这里找到：
宽场应用信函第01号：使用钙指示剂 Fura 2进行宽场钙成像
了解更多关于比率成像的信息
比率成像 – 通过测量荧光探针的变化分析离子浓度
比率成像需要专门的设置
参考文献
Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY: A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (1985) 3440–3450.Takahashi A, Camacho P, Lechleiter JD, Herman B: Measurement of Intracellular Calcium. Physiological Rev 79 (1999) 1089.